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肺癌治疗 测序引物如何与模板互补

经研究发现，PSQ是一种可靠的定量测序合成方法，可以用于确定一个SNP基因型，也可以用于筛选突变、甲基化分析和病毒细菌DNA分型。肺癌转诊治疗机构爱诺美康介绍，相对于其他SNP基因分型方法，只要模板的质量好，PSQ还可以对SNP附近的50~100个碱基序列，进行测序并评估其他的突变。如2、3和4个等位基因的SNP、插入或缺失和点突变。

一个反应中可以分析4~5个位置接近的SNP，1小时内一个板多可以分析96个SNP。该测定法是通过检测PCR反应，互补成实时焦磷酸（PPi）的释放而进行分析。肺癌转诊治疗后，用于PCR合成的三个引物由PSQ检测设计软件设计，可以扩增SNP附近一个100~200bp的DINA序列。其中一条引物的末端被生物素化，以便将PCR产物的一条单链作为PSQ反应的模板。

肺癌转诊治疗机构爱诺美康介绍，测序引物与PSQ模板互补，退火后其末端位于SNP旁或者SNP上游几个碱基。将此测序引物与生物素标记的单链DNA（ssD-NA）模板杂交，并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶混合。这4种dNTP，分别循环反复地轮流加入反应体系。开始进行的是聚合反应，即掺入核苷酸并释放出与掺入的核苷酸等摩尔的PPi。释放出的PPi在ATP硫酸化酶的作用下与腺苷磷酸（APS）反应产生ATP。

进一步驱动荧光素酶，介导荧光素氧化反应，同时产生与ATPM成比例的荧光，用电荷耦合器件（CCD）照相机或光电倍增管拍摄突光，并由专用软件自动分析将pyrogram转换成核苷酸序列。然而，肺癌转诊治疗后，如果DNA浓度很低，则会产生近似噪声水平的荧光峰值信号，这会导致不正确的核苷酸分析结果。

MAS信号，通常需要同时使用多种引物，进行复合焦磷酸测序鉴定。这会产生重叠的引物特异性焦磷酸测序信号，与焦磷酸测序相比，肺癌转诊治疗的这一技术，能将SAS测序信号转换成正确的单链序列，也能将MAS信号转换成与焦磷酸测序软件相应的正确序列。这一测序方法，并不能满足标准测序的需求，因为它检测SNP时读取的长度很短。

两个等位基因特异性引物，都覆盖SNP位点。但是，每一对引物都只与SNP的一个突变序列完全匹配。肺癌转诊治疗后，只有当特异的SNP序列存在时，才会产生相应的产物。不同PCR产物的长度差别很大，不难用凝胶电泳区分。通过T-ARMS-PCR检测一个反应中6个SNP的技术，近被开发出来并且已经用于临床。