爱诺美康

出国就医 反转录酶可从病毒中分离出来

基因表达的研究，从基本PCR之前的一个修正步骤，即反转录中大大受益。利用反转录酶，mRNA的序列转录成了cDNA，并可以作为后续PCR的DNA模板。出国就医服务机构爱诺美康介绍到，大部分的反转录酶是从病毒中分离出来的，例如，鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）、莫罗尼小鼠白血病病毒（MMLV）。AMV反转录酶的优点，是反转录的佳温度是42°C，这对于具有高度二级结构的RNA模板是有利的。

简单地说，该方法涉及利用反转录酶从mRNA到cDNA的初始转化。该方法可以由各种策略来实现，包括使用一种针对感兴趣RNA的下游反义PCR引物、随机六聚体引物，或者以mRNA的多聚腺苷酸尾巴为靶点的低聚糖引物。出国就医后使用反义引物的优势是具有特异性，但是限制了随后的要检测单一产物的PCR过程。

使用随机六聚体引物和低聚糖引物，能得到可以在同一个管子内进行一些独立PCR的cDNA模板。然而，低聚糖引物因其mRNA序列较长，或因具有次级RNA结构而存在保真度的问题。出国就医反转录产生的单链cDNA，在标准PCR的第一个循环中，即可利用Taq聚合酶扩增出双链的dDNA，双链的cDNA在接下来的循环中继续扩增。

随着定量（实时）分析的引入，PCR出现了一项革命性的改进。出国就医方面实时PCR的强大优势，是能够以极高的敏感度，来定量分析反应中的扩增产物。在实时PCR中，扩增和对PCR产物的检测分析同时进行，因为PCR产物是实时合成而不是等到反应的后才合成，而到反应的后才定量分析可能会因反应的平台效应而被误导。

出国就医服务机构爱诺美康介绍到，在每个循环的末尾，检测产生的荧光信号强度（其与累积的PCR产物量成正比），并对PCR循环数绘图。荧光信号强度达到设定阈值，所经历的循环数被称为反应的交叉阈值，或者循环阈值（Ct）。这个阈值是在PCR扩增的对数线性增长阶段的早期设定的，大致与样品中DNA模板的起始量相应。

检测和分析一个特定目标的实时PCR有无数种应用。实时PCR用于定量目的cDNA的基因表达水平是基本的应用。此外，出国就医后依靠化学法和分析软件，扩增后的实时PCR可以用于其他目的，如利用终点分析法，来检测单核苷酸多态性，或通过扩增后融解曲线分析反转录PCR片段长度，及多态性单链构象多态性协议。