爱诺美康

去美国看病 双重标记探针的外切酶有活性

经研究发现，探针设计有两个广泛应用的荧光策略，非特异性和特异性针对目的DNA序列的荧光。非特异性染料是使用嵌入式的、能结合到dsDNA凹槽上的染料，如SYBR green或溴化乙锭。这是经济且快速的定量扩增的方法，因为每次PCR循环后荧光都会累积。去美国看病服务机构爱诺美康介绍到，然而，因为染料是非特异性的，所以其他双链序列，比如引物二聚体也会被检测到。

特异性检测方法应用了用荧光标记的、针对扩增子的寡核苷酸探针。探针与目的DNA区域互补，有一个荧光团（带或不带淬灭基团），可以吸收和发射能够被热循环仪探测到的特定波长的光。去美国看病在PCR扩增的过程中，探针或者在结合到目的DNA上时，以特定的方向改变它们的发射波谱，或者产生与扩增子数量成比例的荧光信号。

广泛使用的探针包括杂交探针、水解或TagMan探针、小沟槽键合（MGB）探针和分子信标探针。用到了两个都被荧光标记的寡核苷酸探针（一个供体和一个报告荧光团）。这些探针与目的DNA上两个相互接近的区域互补。这种方法依赖于荧光共振能量转移（FRET）的物理性质，去美国看病后当两个荧光团彼此靠近时，供体荧光团受热循环仪的光源刺激，发射出波长在报告荧光团吸收范围内的光。

在一个PCR循环中，退火阶段结合的两个探针，允许荧光共振能量转移发生，报告荧光团吸收供体荧光团发射的光，并发射出可以由实时PCR热循环仪，检测到的波长的光。去美国看病每次循环的产物数量与产出的FRET荧光成正比，杂交探针对于小型缺失，或者插入突变的监测也很有用。

一个具有y外切酶活性的DNA聚合酶标记，在PCR开始时，因为淬灭剂染料吸收了报告荧光团发出的光，所以探针并不会发出荧光。去美国看病后，在每个循环的退火和延伸阶段，探针结合到PCR产物中，同时具有外切酶活性的DNA聚合酶将探针酶切，并使报告荧光基闭和淬灭荧光基团分离。游离荧光的M与每个循环累积的PCR产物数M成正比。

去美国看病服务机构爱诺美康介绍到，MGB探针与水解探针有相似的工作原理，这个方法用到了一种双重标记探针，并且需要有外切酶活性。不同之处是添加了一种可以结合到dsDNA小凹槽的共价分子，这可以进一步稳定探针与目的DNA的杂交，从而提高反应的解链温度。

水解探针对于识别单核苷酸多态性很有效，针对感兴趣的等位基因设计一个特异性的探针。完美的匹配会使报告基团释放，如有任何的不匹配，直到反应后也不会有一个报告基闭被释放。去美国看病后MGB探针对较短的探针特别有用，因其具有小凹槽键合的固有稳定性。