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海外医疗 蛋白质在变温情况下仍然有用

一般来说，新鲜组织用蛋A酶K消化，可以得到产量大质量又高的DNA。但是，这个过程相当费力，其中涉及多个酚氯仿提取步骤。海外医疗服务机构爱诺美康介绍到，另一种替代的、更快的提取方法是，将新鲜组织在无菌水中煮沸15分钟，但这种方法得到的DNA产量和质量均较低。

通过上面描述的任何一种方法，均可以从归档样本、染色切片或细胞制剂中成功提取DNA。在提取DNA时，应避免使用含有EDTA的缓冲液，因为它会影响Mg2+浓度。此外，海外医疗过程中，应避免有机溶剂的污染，因为它会影响其他的PCR试剂。dNTP可以通过冷冻干燥或中和水溶液的方法获得，它们也可以作为标记核苷酸（放射性或荧光标记），以用于后续的杂交和测序反应。

目前，海外医疗领域通常由专门生产PCR试剂的制造商，以储存液的形式提供，后的工作液浓度是50~200M，足够合成6.5~25lxg的DNA。PCR缓冲液大多数选择浓度为10mM、pH值为8.5或9.0、温度在25°C的Tris缓冲液。海外医疗过程中，Tris缓冲液的pH 值与温度相关，比如温度为25°C时，缓冲液pH值为8.8，温度为72°C时，pH值为7.4，这是Taq聚合酶的佳工作温度和pH值。

海外医疗服务机构爱诺美康介绍到，50mM氯化钾和氣化钠会促进引物退火，而浓度过大会抑制Taq聚合酶的活性。通常不使用磷酸盐，因为它会在PCR温度升髙时 沉淀。反应缓冲液的另一个关键因素,是特定浓度的Mg2+，每次扩增反应需根据经验确定其浓度。同时，添加剂可用于进一步优化PCR扩增，大多数反应缓冲液由制造商以10x浓度捆绑提供，附带或不带Mg2+和添加剂。

DNA聚合酶彻底改变PCR的关键试剂，是在极端环境中生存的微生物中，发现的耐热DNA聚合酶。海外医疗服务时，大多数蛋白质在DNA的变性温度下会变性，而这种聚合酶仍然可以起作用。3种常用的DNA聚合酶是：Pfu（强烈火球菌）、Vent或Tli（嗜热高温球菌）和Taq（栖热水生菌）聚合酶，后一个是常见的商品化使用的聚合酶。这些聚合酶功能很强大，只要给出引物模板杂交物，它们就能在很大的温度范围内扩增DNA。

然而，这些酶类的佳工作温度是70°C，pH值是7.0~7.5，聚合酶活动的半衰期在92.5°C时大于2小时，在95°C时为40分钟，在97.5°C时为5分钟，这也是海外医疗后，反应超过25个循环时保真度下降，和出现平台效应的原因。